兔抗TopBP1亲和纯化抗体：DNA损伤与复制研究专用

一、产品概述TopBP1DNA拓扑异构酶II结合蛋白1是一种参与DNA拓扑状态调控的关键蛋白。该蛋白通过其C末端区域与拓扑异构酶IIβTopo IIβ相互作用在DNA复制、DNA损伤检查点激活及细胞存活等多个细胞生长调控环节中发挥重要作用。TopBP1含有多个BRCA1 C末端BRCT结构域通过这些结构域与多种蛋白相互作用。研究显示TopBP1可通过不依赖于Rb的机制与E2F1转录因子结合并抑制其活性该过程涉及募集SWI/SNF染色质重塑复合物中的Brg1和Brm蛋白。本文介绍的由艾美捷代理Bethyl Laboratories推出的兔抗TopBP1亲和纯化抗体货号A300-111A由美国生产经抗原亲和纯化适用于小鼠及人源样本的免疫沉淀IP和免疫印迹WB检测。二、核心规格参数参数 | 详细信息靶标 | TopBP1DNA拓扑异构酶II结合蛋白1反应性 | 小鼠人应用 | IP, WB宿主 | 兔克隆性 | 多克隆形式 | 全IgG免疫原 | 人TopBP1蛋白第1472位氨基酸至C末端区间同型 | IgG标记 | 非偶联纯度 | 抗原亲和纯化抗原物种 | 人浓度 | 1000 ug/ml储存条件 | 2 - 8 °C保质期 | 收货后1年缓冲液 | Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH 7-8含0.09%叠氮化钠三、免疫原与识别表位本抗体采用表位特异性亲和纯化工艺制备。将针对TopBP1蛋白的特异性表位固定在固相支持物上从抗血清中亲和捕获并纯化特异性抗体。A300-111A所识别的表位位于人TopBP1蛋白第1400位残基至C末端第1435位残基之间。编号依据NCBI参考序列NP_008958.1GeneID 11073。该区域位于TopBP1的C末端邻近其与拓扑异构酶IIβ相互作用的结构域。四、浓度测定方法免疫球蛋白浓度采用比尔定律测定。标准条件下1 mg/mL IgG在280 nm波长处的吸光度A280为1.4。本抗体浓度为1000 ug/ml即1 mg/ml可直接按体积量取使用。五、应用与实验条件通用说明所有免疫印迹实验均采用5%脱脂牛奶-TBST作为封闭液及抗体稀释液。一抗孵育条件为过夜孵育推荐4°C。推荐稀释比例与用量应用 | 推荐稀释比例/用量免疫沉淀IP | 6 ug/mg 裂解物免疫印迹WB | 1:2000 - 1:10000二抗选择说明细胞裂解物免疫印迹使用山羊抗兔IgG重链和轻链抗体货号A120-101P。该二抗可同时识别兔IgG的重链和轻链适用于检测总IgG信号。免疫沉淀产物的免疫印迹使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清货号S100-020。这一组合的设计目的是免疫沉淀后样本经变性处理会释放抗体的重链约55 kDa和轻链约25 kDa。若使用识别重链和轻链的常规二抗这些抗体片段会产生强烈的背景信号可能掩盖目标蛋白TopBP1分子量约170 kDa的信号。采用轻链特异性二抗只有轻链被检测重链信号不被放大从而显著降低背景干扰。添加正常猪血清可进一步封闭非特异性结合。六、产品使用与储存储存注意事项抗体应储存于2 - 8°C请勿冷冻。反复冻融会导致抗体聚集和活性下降。缓冲液中含有0.09%叠氮化钠作为防腐剂可有效抑制微生物污染。稳定性与保质期自收货之日起在推荐的储存条件下保质期为1年。建议分装为单次使用量储存于2-8°C避免反复开盖引入污染。七、应用要点总结1. 分子量提示TopBP1的预测分子量约为170 kDa。在免疫印迹检测中建议使用4-12% Bis-Tris梯度凝胶或6-8% SDS-PAGE凝胶以获得良好的分辨率。高分子量蛋白的转膜条件需优化建议使用PVDF膜湿转条件100V90-120分钟。2. 免疫沉淀用量每mg细胞裂解蛋白使用6 ug抗体。若TopBP1表达水平较低如在某些非转化细胞系中可适当增加抗体用量至8-10 ug/mg裂解物。建议同时使用同型对照兔IgG作为阴性对照。3. 细胞裂解液选择TopBP1主要定位于细胞核且与染色质紧密结合。推荐使用含高盐如300-400 mM NaCl和核酸酶的裂解缓冲液如RIPA缓冲液或改良的ChIP裂解液以充分释放染色质结合的TopBP1。4. 跨物种验证经验证可识别小鼠和人源TopBP1蛋白。对于大鼠等其他物种建议通过序列比对评估保守性后验证。5. 功能研究价值该抗体识别人TopBP1的C末端区域1400-1435位氨基酸。TopBP1通过其C末端与Topo IIβ相互作用并通过BRCT结构域参与DNA损伤检查点激活特别是ATR-Chk1通路。本抗体适用于研究TopBP1在DNA复制应激响应、检查点信号转导及E2F1转录调控中的分子机制。