不封闭的IHC，你敢试吗？一份来自德国研究团队的可行性研究结果

在免疫组织化学IHC实验的标准操作流程里封闭是必做的一步。我们习惯于在一抗孵育前用山羊血清与二抗同源或BSA对组织切片进行处理。其理论依据是内源性Fc受体会与抗体的Fc段结合引发非特异性染色。然而这一被广泛接受的“常识”却鲜有研究去验证其真伪。2011年德国汉堡血液病理学研究所的团队在Scientific Reports上发表了一项令人深思的文章。他们通过严谨的对照实验证实常规固定后的细胞与组织样本中内源性Fc受体已丧失结合抗体Fc段的能力同时离子与疏水相互作用亦不会引发抗体非特异性结合。因此免疫组化中传统的山羊血清、BSA封闭步骤是非必要的省略该步骤后✔不会产生背景染色✔不影响特异性染色✔可节省实验成本与时间「IHC诊断室」第9期我们一起来学习这篇文章结合实验结果共同探讨免疫组化IHC操作中是否需要封闭步骤呢质疑的起点一个找不到源头的“常识”抗体非特异性结合导致背景染色这一观点在学术界流传已久。Fc受体Fc receptors, FcRs是识别抗体Fc段并介导多种效应功能的关键分子理论上确实可能在IHC检测中与抗体发生结合。尽管有大量的文献提到这一观点但是研究团队却无法追溯到其原始出处。更让研究团队感到费解的是目前的封闭策略。常规封闭是使用二抗来源种属的5-10%正常血清进行孵育以阻断抗体与Fc受体的非特异性结合。他们认为这一做法存在逻辑漏洞很多研究已证实山羊血清根本无法与人类细胞表面的Fc受体结合然而在人类组织免疫检测中绝大多数的二抗源自山羊。尽管如此针对Fc受体或离子、疏水作用介导的非特异性背景进行封闭仍被视作一抗孵育前不可跳过的环节。几乎所有抗体制造商和知名免疫组化平台如IHC WORLD的标准操作流程中都包含了封闭步骤。这种“约定俗成”与科学证据之间的鸿沟促使研究团队展开了系统性的验证。实验设计用数据说话为多维度评估封闭步骤的实际效用研究团队设计了涵盖多种样本类型和检测方法的实验方案样本类型冷冻与石蜡包埋组织切片、细胞培养单层、细胞离心涂片固定与修复用于石蜡包埋的组织样本用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定。切片厚度为4μm经二甲苯和梯度乙醇脱蜡后在家用蒸锅中于95℃在10mM柠檬酸钠缓冲液pH 6.0中加热30分钟进行抗原修复。冰冻组织切片、细胞单层、血细胞涂片和细胞离心涂片用4%甲醛、甲醇或丙酮固定后进行免疫染色。封闭处理5%-10%正常山羊血清或1% BSA对照组省去封闭步骤。抗体体系研究使用了45种小鼠单抗和兔多抗所有抗体均按照说明书的建议使用。一抗的终浓度在1-5 μg/mL。明场染色采用HRP检测系统荧光显色使用与Cy3、Alexa Fluor-488、Alexa Fluor-647等偶联的山羊二抗。二抗的终浓度在5-10 μg/mL。实验结果采用盲法评估由三名科研人员独立判读相邻切片封闭组vs未封闭组的染色差异。结果呈现颠覆认知1、组织切片无差异经常规固定甲醛、丙酮、酒精的人体组织样本中省略封闭步骤后所有抗体均未出现非特异性结合导致的背景染色。具体为冷冻切片人肾脏毛细血管内皮CD34、胰腺癌CK8/18/19、肾脏动脉壁α-SMA均未出现非特异性染色背景干净。石蜡切片人扁桃体CD20、脑星形细胞瘤GFAP、炎性骨组织Col IV同样未出现非特异性结合。特别值得注意的是富含胶原的组织如血管中膜、骨组织常被担忧会因IgG与碱性基团结合而产生背景但实验中各类胶原丰富的样本均未出现假阳性信号。经常规固定后未进行封闭步骤IHC没有非特异性染色。a-c为冷冻组织切片分别为人肾脏毛细血管内皮CD34、人胰腺癌CK8/18/19和人肾脏动脉壁α-SMAd-f为石蜡组织切片分别为人扁桃体CD20、人脑星形细胞瘤EFAP、炎性骨组织Col IV。2、Fc受体富集组织关键验证Fc受体主要在单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、中性粒细胞和血小板表达研究人员对这些细胞丰富的骨髓、脾脏、扁桃体和血细胞样本进行重点检测。正如人扁桃体的CD20和骨髓的CD20、CD61、CD68 IHC结果所示未经封闭的组织样本中没有观察到非特异性染色在阴性对照中也未观察到。因此推断经过常规固定后内源性Fc受体丧失了与IgG抗体Fc段结合的能力。在常规固定的骨髓标本中省略封闭步骤后所有抗体CD20、CD61、CD68未出现非特异性结合。a B淋巴细胞b巨核细胞和血小板c单核/巨噬细胞及树突状细胞。3、多重染色复杂体系验证为排除检测系统的局限性研究人员进一步采用多重荧光免疫染色进行验证。结果显示无论是采用荧光染料偶联抗体还是链霉素亲和素抗体进行单标或多重荧光免疫标记省略封闭步骤均未产生非特异性染色。这一结果通过人乳腺鳞癌组织中的细胞角蛋白5cytokeratin 5, CK5、CK10、CK14的三重免疫荧光染色得到证实。人乳腺鳞癌未经封闭的CK5、CK10、CK14的免疫荧光三重染色结果。a CK14Alexa 488绿色通道b CK10Cy3红色通道c CK5Alexa 647粉色通道d合成图像4、实验动物样本结果相同虽然本次实验主要针对人类患者的组织样本但IHC更多的样本来自实验动物其中啮齿类动物是常用的实验材料。因此研究人员对新生大鼠培养的心肌细胞、小鼠和大鼠的组织样本以及牛和猪的组织样本进行了相同的免疫检测结果发现省去封闭步骤不会产生非特异性背景染色。这一结果与人类细胞和组织样本的一致。实验动物细胞及组织样本未进行封闭的免疫组化染色结果。a新生大鼠心肌细胞Desminb大鼠主动脉壁α-SMAc小鼠脾脏Ki67d小鼠肠道Ki67学术呼应来自另一项独立研究的支持无独有偶2018年美国Kyathanahalli S. Janardhan团队在Toxicol Pathol发表的综述文章进一步支持了这一观点。其数据显示在小鼠脾脏PAX5、小肠Ki67和脑组织GFAP切片中无论是否进行封闭均未出现非特异性染色染色结果高度一致视觉上难以区分。福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中使用血清或其它试剂进行封闭并非关键步骤。小鼠脾脏A、B、小肠C、D、脑E、F切片分别用PAX5、Ki67和GFAP抗体进行染色左侧切片在一抗孵育前用10%正常血清封闭右侧切片未进行封闭。结论与启示重新审视“标准操作”本研究通过系统的对照实验得出了与主流观点相悖却证据充分的结论经甲醛、丙酮或酒精常规固定后内源性Fc受体丧失与IgG抗体Fc段结合的活性同时固定后的样本也不会发生由疏水作用或离子相互作用介导的非特异性结合。因此免疫组化中的传统封闭步骤并非必要。更深层的启示这项研究提醒我们实验室中的“标准操作”可能源于历史沿袭而非实证基础。随着抗体制备技术和免疫技术的发展我们应以批判性思维审视每一个实验步骤或许能够发现更多的优化空间节省实验成本加快科研进度。互动有礼关于IHC封闭大家还有哪些关注的话题吗可以在评论区留言。参考文献1. Buchwalow et al. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci. Rep. 2011. DOI:10.1038/srep000282. Janardhan et al. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicol Pathol. 2018. doi:10.1177/0192623318776907